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    手性色谱柱知识介绍
    日期:2015-3-11 16:42:09 来源:北京色谱信息网   【字体:

    手性色谱柱知识介绍

     

      手性色谱柱(Chiral HPLC Columns)是由具有光学活性的单体,固定在硅胶或其它聚合物上制成手性固定相(Chiral Stationary Phases)。通过引入手性环境使对映异构体间呈现物理特征的差异,从而达到光学异构体拆分的目的。要实现手性识别,手性化合物分子与手性固定相之间至少存在三种相互作用。这种相互作用包括氢键、偶级-偶级作用、π-π作用、静电作用、疏水作用或空间作用。手性分离效果是多种相互作用共同作用的结果。这些相互作用通过影响包埋复合物的形成,特殊位点与分析物的键合等而改变手性分离结果。由于这种作用力较微弱,因此需要仔细调节、优化流动相和温度以达到最佳分离效果。。

     在手性拆分中,温度的影响是很显著的。低温增加手性识别能力,但可能引起色谱峰变宽而导致分离变差。因此确定手性分析方法过程中要考虑柱温的影响,确定最优柱温。

     

        迄今为止,尚没有一种类似十八烷基键合硅胶(ODS)柱的普遍适用的手性柱。不同化学性质的异构体不得不采用不同类型的手性柱,而市售的手性色谱柱通常价格昂贵,因此如何根据化合物的分子结构选择适用的手性色谱柱是非常重要的。

     根据手性固定相和溶剂的相互作用机制,Irving Wainer首次提出了手性色谱柱的分类体系:

     

    1类:通过氢键、π-π作用、偶级-偶级作用形成复合物。

     

    2类:既有类型1中的相互作用,又存在包埋复合物。此类手性色谱柱中典型的是由纤维素及其衍生物制成的手性色谱柱。

     

    3类:基于溶剂进入手性空穴形成包埋复合物。这类手性色谱柱中最典型的是由Armstrong教授开发的环糊精型手性柱[2],另外冠醚型手性柱和螺旋型聚合物,如聚(苯基甲基甲基丙烯酸酯)形成的手性色谱柱也属于此类。

     

    4类:基于形成非对映体的金属络合物,是由Davankov开发的手性分离技术,也称为手性配位交换色谱(CLEC)。

     

    5类:蛋白质型手性色谱柱。手性分离是基于疏水相互作用和极性相互作用实现。

     但由于市场上可选择的手性色谱柱越来越多,此分类系统有时很难将一些手性柱归纳进去。因此参考Irving Wainer的分类方法,根据固定相的化学结构,将手性色谱柱分为以下几种:

     

        刷(Brush)型或称为Prikle

     

        纤维素(Cellulose)型

     

        环糊精(Cyclodextrin)型

     

        大环抗生素(Macrocyclic antibiotics)型

     

        蛋白质(Protein)型

     

        配位交换(|Ligand exchange)型

     

        冠醚(Crown ethers)型

     

        刷型:

     

        环糊精型:

     

        环糊精是通过Bacillus Macerans 淀粉酶或环糊精糖基转移酶水解淀粉得到的环型低聚糖。通过控制环糊精转移酶的水解反应条件可得到不同尺寸的环糊精。市售的环糊精主要是α、β、γ三种类型,分别含678个吡喃葡萄糖单元。环糊精分子成锥筒型,构成一个洞穴,洞穴的孔径由构成环糊精的吡喃葡萄糖的数目决定。环糊精类型及洞穴的孔径等见下表:

     

        环糊精 糖元数目 洞穴孔径 可进入洞穴的分子类型 手性中心数目

     

        α 6 4.5-6.0 5-6元环的芳香族化合物 30

     

        β 7 6.0-8.0 联苯或萘 35

     

        γ 8 8.0-10.0 取代芘和类固醇 40

     

        23位仲羟基分布在环糊精洞口,6位伯羟基在环糊精分子的外部,这意味着洞穴内部是相对疏水的区域。用环糊精手性固定相产生手性识别要求被拆分物的疏水部分能嵌入环糊精洞穴中,形成可逆的、稳定性不同的包合物,环糊精洞口的羟基和被拆分物的极性基团相互作用。

     

       由于形成包合物速度较慢,因此可能导致色谱峰峰形较差,同样也影响了其在制备色谱中的应用。环糊精固定相的选择性取决分析物的分子大小;α-环糊精只能允许单苯基或萘基进入,β-环糊精允许萘基及多取代的苯基进入,γ-环糊精仅用于大分子萜类。β-环糊精手性固定相应用范围最广。Ibuprofen通过β-环糊精色谱柱得到分离,说明了pH值对氢键的影响。当流动相的pH=7时,观察不到拆分的迹象。pH=4时,可达到好的分离效果。通常分离氨基酸时,常采用低的pH值,以抑制酸性基团的离子化,同时也增强氨基的质子化。磷酸三乙胺盐、乙酸三乙胺盐证明对β-环糊精色谱柱来说是很好的缓冲液。通常缓冲液是0.1%三乙胺溶液,用磷酸或醋酸调节到合适的pH值。高的流速会降低形成复合物的能力,低流速分离效果较好,0.5-1ml/min的流速最好。另外,增加缓冲液的浓度可以克服流速的影响,因为它可以增加环糊精洞穴和流动相的吸引力。

     常用缓冲液及其使用浓度如下表所示:

     

        缓冲液 浓度 目的

     

        TEAA(乙酸三乙胺盐) 0.01-2% NH4NO3 10-500mM (用于减小包埋)

     

        柠檬酸盐 10-200mM (特别适合于酸性化合物)

     

        醋酸铵 10-200mM

     

        pH值选择见下表:

     

        醇和胺 pH4(加强NH的离子化)   pH7

     

        优化手性分离条件要考虑的方面有:pH值对分离度的影响;流速对分离度的影响;柱温、有机相比例、缓冲盐浓度对分离度的影响。

     

        环糊精的修饰:最近,对环糊精的修饰使环糊精型手性色谱柱可以分离更多的化合物,并可用于气相手性色谱分离。衍生化是通过将不同的基因键合到环糊精洞穴表面的羟基上。衍生化反应包括乙基化、S-羟基丙基化、生成SR-萘基乙基氨基甲酸盐、35二甲基苯基氨基甲酸盐和环状对甲苯酰酯。这些新型的环糊精固定相有许多优点,它们可以分离更多化合物,价格上也有竞争力,由于改进了手性识别能力使其更适用于制备色谱。

     

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